P1 transdüksiyon yöntemi ile birden fazla gen bakımından mutant olan Escherichia coli suşlarının elde edilmesi

Esra DİBEK; Merve SEZER KÜRKÇÜ; Begüm Hazar ÇİFTÇİ; Bekir ÇÖL

Article Details

P1 transdüksiyon yöntemi ile birden fazla gen bakımından mutant olan Escherichia coli suşlarının elde edilmesi

Authors:

Esra DİBEK | Merve SEZER KÜRKÇÜ | Begüm Hazar ÇİFTÇİ | Bekir ÇÖL

Publisher:

Bitlis Eren University

Journal:

Bitlis Eren Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi 2020 Vol.9 Issue 1, pp.110-119

Document Type:

Article

Publication Date:

3/2020

Document Language:

Turkish

Document ID (Org No.):

2000889242

Frequency:

Quarterly

eISSN:

2147-3188

pISSN:

2147-3129

Keywords:

Abstract:

 


Assigning gene
functions and performing phenotypic studies of the bacteria require the
construction of specific mutants that at times should lack more than one gene
due to the redundancy of particular gene activities. P1 phage is a generalized
transducing phage that can be used in constructing double, triple or multiple
mutants of Escherichia coli. This
phage is able to mistakenly package random fragments of E. coli chromosome (~2 % of the genome into each particle) into the
phage head during phage development.  The
phages with E. coli DNA can inject
that DNA into recipient cells. Given homology between donor and recipient, and
a selectable marker, transductants can be obtained. For transduction, a
virulent derivative of phage P1 is preferably used because this form cannot
integrate into the bacterial genome. The virulent phage can only develop using
the lytic mode of development and produces phage progeny upon lysis of the host
cell. This technique is based on recombination technology, allowing the DNA
fragments of the E. coli genome to be
transported among the strains.





In this study,
we optimized the P1 transduction methodology, which we aim to present to the
Turkish scientific community in the native language with the experimental flow
and sufficient details. For this reason, a number of four single gene mutants
obtained from the KEIO collection were used. First, kanamycine (Kan) gene
cassettes were removed from each mutant strain to create a recipient strain
that is kan sensitive. The other four KEIO mutant strains with KanR
cassettes were used as the donor strains and P1 phage were cultured with these
strains and the lysates were obtained. These lysates and recipient strains were
then transduced to integrate the DNA fragments of the lysates into the
recipient strain genome. Upon selection with kanamycine, new mutant strains,
double mutants are obtained. As a result, four double mutants namely DtsgAugpA, DyhdTompA, DugpAmdtG and DaroGmalF were obtained and the details pertaining to the
protocols and results are presented and discussed.


.

 


Bakterilerde
gen fonksiyonlarının bulunması ve fenotipik çalışmalarının yapılabilmesi için
mutantların oluşturulması gerekmektedir. Bazı durumlarda, birden fazla gen
açısından mutant olan suşlar oluşturulmalıdır çünkü bazı spesifik aktiviteler
birden fazla gen tarafından kodlanmaktadır. P1 fajı, Escherichia coli'de, ikili, üçlü veya çoklu mutantların
oluşturulmasında başvurulan, genelleştirilmiş bir transdüksiyon fajıdır. Bu
faj, gelişimi sırasında, E. coli kromozomunun
parçalarını (her bir partikülde genomun yaklaşık % 2'si olmak üzere), rastgele
bir şekilde faj kafasına paketleyebilmektedir. E. coli DNA’sını içeren fajlar, içerdikleri DNA parçalarını, alıcı
bakteri hücrelerine enjekte edebilmektedir. Verici ve alıcı DNA bölgeleri
arasındaki benzerlik ve seçici bir markır yardımıyla, transdüktanlar’ın elde
edilmesi mümkün olmaktadır. Transdüksiyon için tercihen, P1 fajının, virülan
bir türevi (P1vir) kullanılmaktadır, çünkü bu form, bakterinin genomuna entegre
olamamaktadır. Fajın bu özelliğinin kullanılmasıyla geliştirilen tekniklerden
birisi, P1 transdüksiyon tekniği olarak adlandırılmaktadır. Rekombinasyon
teknolojisinde kullanılan bu teknik, E.
coli genomuna ait DNA parçalarının, suşlar arasında taşınmasını
sağlamaktadır.


Bu
çalışmada, optimize ettiğimiz P1 transdüksiyon metodolojisinin, deneysel akış
ve yeterli detaylarla birlikte, Türk bilim camiasına, ana dilimizde sunulması
amaçlanmıştır. Bunun için, KEIO koleksiyonundan elde edilen dört adet tekli gen
mutantları kullanılmıştır. İlk olarak, kanamisin (Kan) duyarlı bir alıcı suş
oluşturmak için, her bir mutant suştan, Kan gen kasetleri çıkarılmıştır. KanR
kasetlerine sahip diğer dört adet KEIO mutant suşu, donör suşlar olarak
kullanılmış ve P1 fajı bu suşlar ile kültür edilerek, lizatlar elde edilmiştir.
Bu lizatlar ve alıcı suşlar daha sonra, lizatlardaki fazjların içerdikleri DNA
parçalarını, alıcı suş genomuna entegre edebilmesi için, transdüksiyona tabii
tutulmuştur. Kanamisin ile seleksiyon sonucu, yeni mutant suşlar olan ikili
mutantlar elde edilmiştir. Sonuçta, isimleri DtsgAugpA, DyhdTompA, DugpAmdtG
ve DaroGmalF olan, dört adet
ikili mutant oluşturulmuştur. Deneysel akıştaki ilgili protokoller ve sonuçlara
ait detaylar sunulmuş ve tartışılmıştır.


.

Article Details

P1 transdüksiyon yöntemi ile birden fazla gen bakımından mutant olan Escherichia coli suşlarının elde edilmesi

Authors: Esra DİBEK | Merve SEZER KÜRKÇÜ | Begüm Hazar ÇİFTÇİ | Bekir ÇÖL

Publisher: Bitlis Eren University

Journal: Bitlis Eren Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi 2020 Vol.9 Issue 1, pp.110-119

Document Type: Article

Publication Date: 3/2020

Document Language: Turkish

Document ID (Org No.): 2000889242

Frequency: Quarterly

eISSN: 2147-3188

pISSN: 2147-3129

P1 faj

transdüksiyon

Escherichia coli

ikili mutant

Issues

Authors:

Esra DİBEK | Merve SEZER KÜRKÇÜ | Begüm Hazar ÇİFTÇİ | Bekir ÇÖL

Publisher:

Bitlis Eren University

Journal:

Bitlis Eren Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi 2020 Vol.9 Issue 1, pp.110-119

Document Type:

Article

Publication Date:

3/2020

Document Language:

Turkish

Document ID (Org No.):

2000889242

Frequency:

Quarterly

eISSN:

2147-3188

pISSN:

2147-3129